УДК 582.683.2:58.08

DOI: 10.24412/cl-36359-2021-793-798

ВИДОВАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ УРАЛЬСКИХ ALYSSEAE НА ОСНОВАНИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ЯДЕРНОЙ И ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК

SPECIES OF ALYSSEAE FROM THE URALS BASED ON THE SEQUENCES OF NUCLEAR AND CHLOROPLAST DNA

А.Ю. Тептина, Е.Д. Балеевских, А.А. Ермошин, Е.П. Круглова, К.А. Паниковская, А.Г. Пауков, М.В. Терентьева

A.Yu. Teptina, E.D. Baleevskikh, A.A. Ermoshin, E.P. Kruglova, K.A. Panikovskaya, A.G. Paukov, M.V. Terentyeva

Уральский федеральный университет, Екатеринбург, Россия

Ural Federal University, Ekaterinburg, Russia

E-mail: ateptina@gmail.com

Аннотация. Изучены последовательности ITS и trnL IGS представителей Alyssum obovatum, A. tortuosum и A. litvinovii, обитающих на Урале. Последовательности trnL не дали деревьев с высокой поддержкой. ITS филогения свидетельствует о родстве изученных уральских образцов и принадлежности их к Alyssum obovatum s. l., который имеет региональные различия на протяжении ареала. Обсуждается необходимость определения признаков A. tortuosum sensu stricto.

Ключевые слова: Alyssum, Odontarrhena, генетическая структура, ITS, trnL.

Abstract.ITS и trnL IGS sequences were studied in three putative Alyssum species, Alyssum obovatum, A. tortuosum, and A. litvinovii collected in the Urals. trnL sequences did not give highly supported trees. ITS phylogeny showed a close relationship between the studied taxa and their possible affiliation to Alyssum obovatum s.l. which has a wide range and regional differences. The necessity of distinction of characters of A. tortuosum s.s. is discussed.

Keywords: Alyssum, Odontarrhena, genetical structure, ITS, trnL.

Род Alyssum L. входит в трибу Alysseae семейства Brassicaceae [13], областью распространения которой являются Евразия и Северная Африка, и только один вид, Alyssum obovatum (C.A. Mey.) Turcz., встречается в Северной Америке.

T.R. Dudley [9] подразделял род на пять секций: Alyssum, Psilonema, Meniocus, Gamosepalum и Odontarrhena. Впоследствии многие исследователи приходили к заключению, что данное разделение на секции требует пересмотра и ни одна из классически выделяемых секций по T.R. Dudley [9] не является естественной группой. До настоящего времени было предложено несколько классификационных систем рода Alyssum, существенно различающихся по числу видов, числу и составу секций [5, 25, 8, 10, 16]. Недавние исследования трибы Alysseae [17] позволили восстановить ряд таксонов из рода Alyssum L. в Odontarrhena C.A. Mey. ex Ledeb. Odontarrhena отличается от Alyssum по молекулярным маркерам и морфологическим признакам (сложные соцветия и односемянные локулы стручочков у Odontarrhena в отличие от простых кистей и стручочков с двумя семенами в каждой локуле у Alyssum). Несмотря на ясность в определении секции Odontarrhena, отношения внутри нее остаются не выясненными. В секции классически выделяют три клады: Inflata, Compressa и Samarifera [9], монофилия которых, согласно молекулярным данным, пока не находит подтверждения. Слабые морфологические отличия и низкий уровень генетического разнообразия делают выделение внутрисекционных отношений сложной задачей.

Еще одним фактором, помимо запутанной филогении, усложняющим исследование рода Alyssum является разнообразие цитотипов у его представителей. В семействе Brassicaceae 37% представителей – полиплоиды [24]. Наиболее распространенное хромосомное число – 8, более редкие варианты: 7, 11, 15. Виды Alyssum также бывают ди- и полиплоидами, а также широко распространены диплоидно-полиплоидные комплексы в пределах популяций видов [19, 20].

Ряд молекулярно-генетических исследований связан со способностью представителей Odontarrhena к гипераккумуляции никеля и цинка в надземной массе [14]. R.R. Brooks [7] считал, что центр зарождения и распространения гипераккумулирующих растений находится на территории Турции, об этом свидетельствует большое количество видов-гипераккумуляторов в данном регионе, а также рекордные показатели накопления тяжелых металлов. Автор рассматривает Турцию как центр происхождения и дальнейшей экспансии секции Odontarrhena. Другой точки зрения придерживаются A. Mengoni с соавторами [7], которые в своем исследовании взаимосвязи филогении рода и способности к гипераккумуляции Ni с использованием анализа ITS не обнаружили территориальной близости у гипераккумулирующих видов Alyssum, и выразили сомнение в единстве ее происхождения. Гипераккумуляция Ni могла быть как утеряна, так и приобретена независимо более одного раза в процессе видообразования.

На Урале встречаются представители секции Odontarrhena – Alyssum obovatum и A. tortuosum, а также локальный эндемик A. litvinovii Knjaz., известный только из Оренбургской области [1]. Характерной особенностью этих видов является предрасположенность к произрастанию на ультраосновных породах и способность к аккумуляции никеля [3, 4, 23]. К секции Alyssum принадлежит один уральский вид – A. lenense Adams, встречающийся на различных горных породах, но не содержащий повышенных концентраций никеля и хорошо морфологически отличающийся от других видов рода. Различия между особями, относимыми к A. obovatum и A. tortuosum менее очевидны, и растения сложно отличить друг от друга. Alyssum tortuosum имеет более южное распространение, встречаясь на юге Челябинской и в Оренбургской области, A. obovatum обычен на севере Челябинской и в Свердловской области [2]. Происхождение A. litvinovii остается невыясненным; вид имеет характерную морфологию, компактные размеры, слегка суккулентные листья и произрастает на карбонатизированных серпентинитах в единственном локалитете в Оренбургской области.

Образцы, относимые к Alyssum obovatum, и произрастающие на серпентинитах, характеризуются высоким содержанием никеля (выше 6000 мг/кг) и относятся к гипераккумуляторам этого металла [4]. Для A. tortuosum характерна межпопуляционная изменчивость по уровню накопления никеля. Одна из исследованных популяций из Хабарнинского массива показала уровень накопления никеля в среднем 1789,34 мг/кг, что позволяет причислить ее к числу гипераккумуляторов – он в два раза превысил показатели других популяций. Эти различия могут быть вызваны как характеристиками субстрата, так и особенностями самих растений.

Для дальнейших исследований экологии видов и особенностей гипераккумуляции необходимо провести четкое разграничение пары Alyssum obovatum и A. tortousum, найти географическую границу, разделяющие эти таксоны на Урале, а также выявить родственные отношения A. litvinovii.

Материал и методы. Материалом для исследования явились особи Alyssum obovatum, A. tortuosum и A. litvinovii из семейства Brassicaceae, собранные в ценопопуляциях видов на Среднем и Южном Урале в июне 2017 и 2018 года на территории Оренбургской, Челябинской, Свердловской области и в Республике Башкортостан на возвышенных частях ультраосновных массивов. Листья растений помещались в силикагель, затем замораживались; плоды с семенами собирались в бумажные пакеты и хранились в сухом состоянии при комнатной температуре.

Выделение геномной ДНК из зелёных частей растений (сухих вегетативных частей и проростков) и очистка производилась с использованием наборов diaGene (Диа-М, Москва) согласно инструкциям производителя. Смесь для ПЦР состояла из реакционной смеси с Taq-полимеразой (БиоЛабСервис, Новосибирск) согласно рекомендациям производителя, праймеров ITS5, ITS4 [26]; trnL e и f [22] по одному микролитру, 2 мкл ДНК и стерилизованной воды до объема 25 мкл. Реакцию проводили в амплификаторе (Bio Rad T100 Thermal Cycler) в соответствии с процедурами, описанными в работе Я. Ли [12]. Оценка наличия и длины амплифицированных фрагментов проводилась методом гель-электрофореза на агарозном геле. Праймерная реакция проведена с использованием набора Brilliant Dye (Nimagen, Нидерланды). Образцы секвенировались методом Сенгера на секвенаторе Applied Biosystems в лаборатории молекулярной генетики ИЕНиМ.

В результате исследования были собраны образцы из 30 популяций, из которых проанализировано 10 образцов, представляющих три предполагаемые вида Alyssum. Последовательности ITS и trnL IGS хорошего качества получены из одного образца Alyssum litvinovii, трех ‘A. tortuosum’ и одного ‘A. obovatum’.

Полученные последовательности обрабатывались в программе BioEdit, где они проверялась на наличие сомнительных в точности определения нуклеотидов. Поиск последовательностей, схожих с полученными, производился с помощью ресурса Blast [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. Дальнейшее сравнение и выравнивание данных было осуществлено с использованием сервиса Mafft [https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/]. Байесовы филогенетические деревья построены в программе Beast [21]. Итоговое филогенетическое дерево строилось в программе TreeAnnotator из пакета Beast и визуализировалось в программе FigTree 1.4.4 [http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/].

Результаты и осуждение. В ходе работы построены два филогенетических дерева, включающие образцы изучаемых видов из Урала и различных регионов Евразии и Северной Америки. Филогенетическое дерево, основанное на последовательностях ITS (рисунок 1), выявляет несколько групп с высокой поддержкой. Ветвь c поддержкой 0,95, включающая все исследованные образцы из Среднего и Южного Урала, подразделяется на три группы, разделяющиеся по географическому принципу: к первой относится большинство изученных образцов (номера 2, 10, 19 и 27) и образец Alyssum obovatum (EF514621) из Семипалатинской области. Вторая группа включает образец ‘Alyssum tortuosum’ номер 12 и последовательности из растений, произрастающих в Сибири и на Дальнем Востоке России. К третьей группе принадлежат в основном образцы из Северной Америки, определенные как ‘Alyssum americanum’, признанным в настоящее время синонимом Alyssum obovatum. К ним присоединяется Alyssum tortuosum (KF022604) из Венгрии, откуда был описан данный вид.

Вторая ветвь с поддержкой 0,96 включает два европейских вида, Alyssum bertolonii Desv. и A. tavolarae Briq., а также образец Alyssum obovatum (EF514616) из Дальнего Востока и A. tortuosum (KF022605) из Ростовской области. Еще один образец, отнесенный к A. tortuosum (EF514625) происходит из Туркменистана и характеризуется последовательностью ITS, схожей с европейскими Alyssum murale Waldst. & Kit. и A. filiforme Nyár.

Дерево, построенное на основании trnL IGS, характеризуется низкой поддержкой в связи с невысоким варьированием в нуклеотидных последовательностях, заметно отличающихся только в родах Clypeola и Meniocus, использованных как внешняя группа. Несмотря на это, хлоропластные последовательности изученных образцов также сформировали компактную группу, отличающуюся от родственных таксонов. Образец Alyssum litvinovii, тем не менее, оказался близок к европейскому Alyssum giosnanum Nyár., однако различия в нескольких нуклеотидах, обнаруженных, в спейсере, недостаточно для суждения о существенном отличии данного образца от других южноуральских представителей Alyssum.

Предварительные данные свидетельствуют о родстве большинства представителей секции Odontarrhena умеренной зоны Евразии и Северной Америки, которые можно рассматривать как Alyssum obovatum sensu lato. Мы не обнаружили существенных различий в последовательностях ITS изученных образцов из Урала и, таким образом, принимаем отнесение уральских ‘Alyssum obovatum’ и ‘A. tortuosum’ к этому комплексу учитывая также и отсутствие заметных морфологических различий между ними. В то же время сходный Alyssum litvinovii благодаря специфичной морфологии и отличиям хлоропластных последовательностей заслуживает сохранения в отдельном таксоне. Несмотря на сходства на широком протяжении ареала, популяции Alyssum obovatum s. l., тем не менее, имеют региональные различия в последовательностях ITS, которые свидетельствуют о происходящих микроэволюционных процессах в удаленных популяциях, которые, наряду с возможной морфологической вариабельностью, возможно, заслуживают в ряде случаев как подвидового, так и видового статуса.

Другие виды, использованные в анализе, в большинстве хорошо отличаются генетически. В Европе Alyssum, встречающийся в южной части континента, вероятно, является реликтом доледникового периода. В период Плейстоценового оледенения Аппенинский, Балканский и Пиренейский полуострова служили рефугиумом для многих современных видов [6, 11, 15]. Благодаря длительному существованию и большой численности средиземноморские популяции сохранили высокие показатели генетического разнообразия, в отличие от северных, претерпевших ряд «бутылочных горлышек».

Позиция Alyssum tortuosum sensu stricto в филогении рода, однако, остается не ясной. Образец из Венгрии является родственным комплексу Alyssum obovatum s. l. и наиболее близок к ‘Alyssum americanum’, однако единственный образец не дает возможности судить о его точном положении в филогении. Представители вида из Ростовской области и Туркменистана, вероятно, относятся к другим видам, близким к средиземноморским таксонам. Для выяснения статуса Alyssum tortuosum необходим дополнительный материал из типового локалитета, характеризующий генетические особенности материала, на котором основано описание вида, а также оценка его морфологической вариабельности. Кроме этого, необходим поиск новых ДНК последовательностей и методов, которые позволили бы с более высокой чувствительностью разграничивать таксоны в пределах рода Alyssum.

Исследование проведено при поддержке РФФИ (Проект № 16-04-01346).

Cписок литературы

1. Князев М.С. Заметки о некоторых видах крестоцветных (Brassicaceae) на Урале и сопредельных территориях // Новости сист. высш. раст. 2011. Т. 42. С. 136-146.

2. Куликов П.В. Конспект флоры Челябинской области (сосудистые растения). Екатеринбург – Миасс: Геотур, 2005. 537 с.

3. Тептина А.Ю., Пауков А.Г. Петрофитно-степная флора и растительность гипербазитов Южного Урала // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2012. Т. 14, № 1(7). С. 1860-1863.

4. Тептина А.Ю., Пауков А.Г., Морозова М.В. Аккумуляция Ni представителями семейства Brassicaceae на почвах ультраосновных пород Южного и Среднего Урала // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. 2016. № 4(157). С. 110-117.

5. Al-Shehbaz I.A., Beilstein M.A., Kellogg E.A. Systematics and phylogeny of the Brassicaceae (Cruciferae): an overview // Plant Systematics and Evolution. 2006. V. 259. P. 89-120.

6. Bilton D.T., Mirol P.M., Mascheretti S., Fredga K., Zima J., Searle J.B. Mediterranean Europe as an area of endemism for small mammals rather than a source for northwards postglacial recolonization // Proceedings of the Royal Society of London. 1998. V. B 265. P. 1219-1226.

7. Brooks R.R. Serpentine and its Vegetation. A Multidisciplinary Approch.  USA: Discorides Press, 1987. 332 p.

8. Cecchi L., Gabbrielli R., Arnetoli M., Gonnelli C., Hasko A., Selvi F. Evolutionary lineages of nickel hyperaccumulation and systematics in European Alysseae (Brassicaceae): evidence from nrDNA sequence data // Annals of Botany. 2010. V. 106, № 5. P. 751-767.

9. Dudley T.R. Synopsis of the genus Alyssum // Journal of the Arnold Arboretum. 1964. V. 45, № 3. P. 358-373.

10. German D.A., Al-Shehbaz I.A. Nomenclatural novelties in miscellaneous Asian Brassicaceae (Cruciferae) // Nordic Journal of Botany. 2010. V. 28, № 6. P. 646-651.

11. Hewitt G.M. Post-glacial recolonisation of European biota // Biological Journal of the Linnean Society. 1999. V. 68. P. 87-112.

12. Li Y., Feng Y., Lv G., Liu B., Qi A. The phylogeny of Alyssum (Brassicaceae) inferred from molecular data // Nordic Journal of Botany. 2015. V. 33. P. 715-721.

13. Li Y., Lv G., He X., Zhang X., Yang, X. The complete chloroplast genome of the spring ephemeral plant Alyssum desertorum and its implications for the phylogenetic position of the tribe Alysseae within the Brassicaceae // Nordic Journal of Botany. 2017. V. 35, № 6. P. 644-652.

14. Mengoni A., Baker A.J. M., Bazzicalupo M., Reeves R.D., Adigüzel N., Chianni E. Evolutionary dynamics of nickel hyperaccumulation in Alyssum revealed by ITS nrDNA analysis // New Phytologist. 2003. V. 159, № 3. P. 691-699.

15. Petit R.J., Auinagalde I., de Beaulieu J-L. et al. Glacial refu‐ gia: hotspots but not melting pots of genetic diversity // Science. 2003. V. 300. P. 563-1565.

16. Rešetnik I., Satovic Z., Schneeweiss G.M., Liber Z. Phylogenetic relationships in Brassicaceae tribe Alysseae inferred from nuclear ribosomal and chloroplast DNA sequence data // Molec. Phylogenet. Evol. 2013. V. 69. P 772-785.

17. Španiel S., Kempa M., Salmerón-Sánchez E., Fuertes-Aguilar J., Mota J.F., Al-Shehbaz I.A. AlyBase: database of names, chromosome numbers, and ploidy levels of Alysseae (Brassicaceae), with a new generic concept of the tribe // Plant systematics and evolution. 2015. V. 301, № 10. P. 2463-2491.

18. Španiel S., Marhold K., Filová B., Zozomová-Lihová J. Genetic and morphological variation in the diploid–polyploid Alyssum montanum in Central Europe: taxonomic and evolutionary considerations // Plant Systematics and Evolution. 2011. V. 294, № 1. P. 24-27.

19. Španiel S., Marhold K., Passalacqua N. G., Zozomová-Lihová J. Intricate variation patterns in the diploid-polyploid complex of Alyssum montanum – A. repens (Brassicaceae) in the Apennine Peninsula: Evidence for long-term persistence and diversification // American Journal of Botany. 2011. V. 98, № 11. P. 1887-1904.

20. Španiel S., Zozomová-Lihová J., Passalacqua N. G., Marhold K. Infraspecific classification of Alyssum diffusum (Brassicaceae) in Italy //Willdenowia. 2012. V. 42, № 1. P. 37-56.

21. Suchard M. A., Lemey P., Baele G., Ayres D. L., Drummond A. J., Rambaut A. Bayesian phylogenetic and phylodynamic data integration using BEAST 1.10 // Virus Evolution. 2018. V. 4, № 1. P. 1–5.

22. Taberlet P., Gielly L., Pautou G., Bouvet J. Universal primers for amplification of three noncoding regions of chloroplast DNA // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 1105–1109.

23. Teptina A.Y., Paukov A.G. Nickel accumulation by species of Alyssum and Noccaea (Brassicaceae) from ultramafic soils in the Urals, Russia // Australian Journal of Botany. 2015. V. 63, № 2. P. 78-84.

24. Warwick S.I., Al-Shehbaz I.A. Brassicaceae: chromosome number index and database on CD-Rom // Plant Systematics and Evolution. 2006. V. 259, № 2. P. 237-248.

25. Warwick S.I., Sauder C.A., Al-Shehbaz I.A. Phylogenetic relationships in the tribe Alysseae (Brassicaceae) based on nuclear ribosomal ITS DNA sequences // Botany. 2008. V. 86. P. 315-336.

26. White T.J. et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics // PCR protocols. 1990. V. 18. P. 315-322.